ANALISIS KUALITATIF PROTEIN


ANALISIS PROTEIN DENGAN CARA KUALITATIF (PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL, DENATURASI)

Dudi Damaraa, Hanief Ilestin Maharanib dan Ridwan Lukman Nulhakimc

Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian, Universitas Garut

Jl. Raya Samarang No. 52 Telp. 0262 544217

Email: dudi.damara@gmail.com

Dikumpulkan pada tanggal 08 Mei 2017

ABSTRAK

Analisis protein yang digunakan adalah pengendapan protein dengan alkohol dan denaturasi. Praktikum ini bertujuan untuk menjelaskan prinsip dan mempraktekkan pengujian protein secara kualitatif, yaitu uji pengendapan protein dengan alkohol dan denaturasi pada bahan pangan. Prinsip kerja pada pengendapan protein dengan alkohol adalah protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang,  dan juga karena alkohol akan berkompetensi dengan protein terhadap air. Sedangkan pada denaturasi adalah terpecahnya hidrogen, ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipeptida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida). Hasil dari uji pengendapan protein dengan alkohol dan denaturasi positif setiap bahan yang di uji yaitu susu murni, susu kedelai, putih telur dan santan dengan pereaksi yang digunakan yaitu HCl, NaOH, asam asetat dan etanol yang digunakan terbentuk endapan terkecuali susu murni dengan pereaksi  HClI dan NaOHII pada uji pengendapan dengan alkohol dan susu kedelai dengan pereaksi  NaOHII pada uji denaturasi, tidak terbentuk endapan dapat terjadi karena HCl dan NaOH yang ditambahkan tidak cukup banyak atau dari konsentrasi pereaksinya, sehingga belum mampu untuk mendenaturasikan protein yang terdapat dalam larutan.

Kata kunci : Alkohol, denaturasi, koagulasi, putih telur, santan

PENDAHULUAN

Protein adalah senyawa organik yang tersusun dari monomer-monomer asam amino yang saling berinteraksi melalui ikatan peptida (Chang dkk, 2008). Molekul protein mengandung kompisisi rata-rata unsur kimia, yaitu karbohidrat 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 26% dan kadang kala sulfur 0-3% serta fosfor 0-3%. Protein dapat tidak stabil terhadap beberapa faktor, yaitu pH, radiasi, suhu, medium pelarut organik dan detergen (Elisa, 2014).

Menurut sumbernya protein dibagi menjadi dua golongan, yaitu protein hewani dan protein nabati (Bambang dkk, 2003).Protein hewani adalah protein yang berasal dari hewan, sedangkan protein nabati adalah protein yang berasal dari tumbuhan. Bahan uji analisis protein pada praktikum ini adalah putih telur, susu murni (protein hewani) dan  santan, susu kedelai (protein nabati).

Fungsi dari protein adalah sebagai katalis enzimatik, alat pengangkut dan alat penyimpan, pengatur pergerakan, penunjang mekanis, pertahanan tubuh (imunisasi), membangkitkan dan menghantar impuls saraf serta pengendalian pertumbuhan dan diferensiasi (Dewi, 2013).

Pengujian protein dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengujian protein pada praktikum ini dilakukan secara kualitatif, yaitu pengendapan protein dengan alkohol dan denaturasi. Prinsip pada pengendapan protein dengan alkohol adalah protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang,  dan juga karena alkohol akan berkompetensi dengan protein terhadap air. Sedangkan pada denaturasi adalah terpecahnya hidrogen, ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipeptida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida).

Praktikum ini bertujuan untuk menjelaskan prinsip dan mempraktekkan pengujian protein secara kualitatif, yaitu uji pengendapan protein dengan alkohol dan denaturasi pada bahan pangan.

METODOLOGI

Praktikum ini dilaksanakan pada hari sabtu, 29 April 2017 13.00-15.00 WIB

di Laboratorium terpadu Fakultas Pertanian, Universitas Garut.

Pengendapan Protein Dengan Alkohol 

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah gelas kimia, spatula stainless, tabung reaksi, penjepit tabung reaksi dan rak tabung reaksi. Bahan yang digunakan adalah susu murni, susu kedelai, putih telur, santan, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat 1M (pH 4,7) dan etanol 95 %.

Prosedur Kerja

Sediakan 3 tabung reaksi dan isi masing-masing tabung reaksi dengan 5 mL larutan protein. Kedalam tabung I tambahkan 1 mL HCl 0,1 M dan 6 mL etanol 95%, tabung II 1 mL NaOH 0,1 M dan 6 mL etanol 95%, tabung III 1 mL buffer asetat dan 6 mL etanol 95 %. Tabung-tabung mana yang tidak larut.

Denaturasi

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah gelas kimia, spatula stainless, tabung reaksi, penjepit tabung reaksi dan rak tabung reaksi. Bahan yang digunakan adalah susu murni, susu kedelai, putih telur, santan, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M dan buffer asetat 1M (pH 4,7).

Prosedur Kerja

Sediakan 3 tabung reaksi dan isi masing-masing tabung reaksi dengan 9 mL larutan protein. Kedalam tabung I tambahkan 1 mL HCl 0,1 M, tabung II 1 mL NaOH 0,1 M, tabung III 1 mL buffer asetat. Tempatkan ketiga tabung dalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan pada temperatur kamar. Lihat ke dalam tabung mana terjadi endapan. Lanjutkan percobaan di atas terhadap tabung I dan II dengan menambahkan 10 mL buffer asetat.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengendapan Dengan Alkohol

Alkohol merupakan senyawa seperti air yang satu hidrogennya diganti oleh rantai atau cincin hidrokarbon. Sifat fisis alkohol, alkohol mempunya titik didih yang tinggi dibandingkan alkana-alkana yang jumlah atom C nya sama. Hal ini disebabkan anatra molekul alkohol membentuk ikatan hydrogen. Rumus umum alkohil R-OH, dengan R adalah suatu alkil baik alifatis maupun siklik. Dalam alkohol, semakin banyak cabang semakin rendah titik didihnya. Sedangkan dalam air, metanol, etanol, propanol mudah larut dan hanya butanol yang sedikit larut. Alkohol dapat berupa cairan encer dan mudah bercampur dengan air dalam segala perbandingan (Brady dkk, 1999).

Faktor yang mempengaruhi denaturasi yang terdapat pada uji denaturasi adalah pemanasan pada suhu 55-750C, suhu rendah (dibawah titik beku air), pH yang ekstrim, pelarut organik, penambahan garam dan pengadukan intensif. Pada uji ini pereaksi yang digunakan selain asam asetat yang bersifat asam lemah, HCl asam kuat dan NaOH bersifat basa kuat adalah penggunaan pereaksi etanol. Etanol adalah termasuk alkohol dan perarut organik.

Penambahan pelarut organik akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan. Dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan (Muslim dkk, 2010).

Pada Tabel 1. bahan yang diuji menggunakan etanol terjadi endapan. Menurut (Rismaka, 2009), alkohol dapat mengendapkan protein karena gugus fungsional dari alkohol lebih kuat mengikat air sehingga kelarutan protein dalam air berkurang. Pada protein ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukan oleh adanya endapan yang terbentuk. Penentuan protein metode pengendapan alkohol adalah kompetensi pembentukan antara protein-air dengan alkohol-air.

Endapan yang tidak terbentuk pada bahan susu murni dengan pereaksi  HClI dan NaOHII dapat terjadi karena HCl dan NaOH yang ditambahkan tidak cukup banyak atau dari konsentrasi pereaksinya, sehingga belum mampu untuk mendenaturasikan protein yang terdapat dalam larutan.

 

Tabel 1. Hasil pengendapan protein dengan alkohol

Pereaksi P. Telur S. Kedelai S. Murni
HClI + +
EtanolI + + ++
NaOHII + +
EtanolII +++ +++ +
AsetatIII ++ +++ +
EtanolIII ++ +++ +++

Keterangan : tidak ada endapan (-), sangat sedikit (+), sedikit (++), banyak (+++)

Denaturasi

Denaturasi protein adalah suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tertier dan kuartener tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovelen serta terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan atau wiru molekul protein (Winarno, 1997). Ada dua macam denaturasi protein, yaitu pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa disertai pengembangan molekul. Terjadinya kedua jenis denaturasi ini tergantung pada keadaan molekul, yang pertama terjadi pada rantai polipeptida, sedangkan yang kedua terjadi pada bagian-bagian molekul yang tergabung dalam ikatan sekunder. Ikatan- ikatan yang dipengaruhi oleh proses denaturasi ini adalah ikatan hidrogen dan Ikatan hidrofobik (Triyono, 2010)

Menurut (Triyono, 2010) menyatakan ikatan peptida protein tidak seluruhnya dapat terputus akibat denaturasi, karena struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, rantai garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein. Protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul bagian dalam yang bersifat hidrofobik akan keluar sedangkan bagian hidrofilik akan terlipat ke dalam. Pelipatan atau pembalikkan akan terjadi bila protein mendekati pH isoelektris lalu protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah karena molekul mengembang menjadi asimetrik, sudut putaran optis larutan protein juga akan meningkat.

Protein yang terdenaturasi akan mengendap karena gugus-gugus yang bermuatan positif dan negatif dalam jumlah yang sama atau netral atau dalam keadaan titik isoelektrik. Pada denaturasi terjadi pemutusan ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan ikatan garam hingga molekul protein tidak punya lipatan lagi. Pengembangan molekul protein yang terdenaturasi akan membuka gugus reaktif yang ada pada rantai polipeptida. Selanjutnya akan terjadi pengikatan kembali pada gugus reaktif yang sama atau berdekatan. Bila unit ikatan yang terbentuk cukup banyak sehingga protein tidak lagi terdispersi sebagai suatu koloid, maka protein akan mengalami denaturasi. Apabila ikatan-ikatan antara gugus-gugus reaktif protein tersebut menahan seluruh cairan, akan terbentuklah gel. Sedangkan bila cairan terpisah dari protein yang terdenaturasi itu, maka protein akan mengendap (Martoharsono,2006).

Faktor yang mempengaruhi denaturasi adalah pemanasan pada suhu 55-750C, suhu rendah (dibawah titik beku air), pH yang ekstrim, pelarut organik, penambahan garam dan pengadukan intensif.

Pada Tabel 2. setiap bahan yang di ujikan terbentuk endapan kecuali pada bahan susu kedelai dengan pereaksi  NaOHII. Endapan ini terbentuk karena disebabkan denaturasi protein, yaitu pemanasan dan penambahan asam. Pemanasan dan penambahan asam ini akan menyebabkan rusaknya struktur protein sehingga protein akan mengendap.

Pada uji denaturasi dengan asam, molekul protein memiliki gugus amina (NH2) dan gugus karboksil (COOH)  pada salah satu ujung rantainya. Hal ini menyebabkan protein bersifat amfoter sehingga dapat bereaksi dengan asam maupun basa (Bintang, 2010). Pada pH tertentu muatan gugus amino dan karboksilat saling mentetralkan sehingga molekul protein tidak bermuatan. Titik isoelektrik adalah pH dimana suatu asam tidak mengandung muatan ion. Pada titik isoelektrik, terdapat kesetimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion dan kation (Fesseden, 1986). Pada pH dibawah titik isoelektrik (asam), gugus amina pada protein akan bereaksi dan ion H menjadi NH3 sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya pada pH diatas titik isoelektrik (basa), gugus karboksil akan bereaksi dengan ion OH sehingga protein bermuatan negatif (Bintang, 2010). Pada titik isoelektrik kelarutan protein menurun dan mencapai angka terendah. Pada keadaan ini kelarutan protein dalam air paling kecil sehingga protein akan mengendap.

Bahan pereaksi pada uji ini adalah asam asetat yang bersifat asam lemah, HCl asam kuat dan NaOH bersifat basa kuat. Dari ketiga jenis asam tersebut mempunyai perbedaan sifat daya koagulasi yang berbeda. Larutan yang bersifat asam akan mendonorkan proton (H+) sedangkan pada larutan yang bersifat basa akan mondonorkan OH. Ion H+ serta ion OH yang ditambahkan dalam larutan protein dapat mengganggu struktur tersiernya yang diakibatkan oleh ikatan elektristatik. Jika ikatan elektrostatisnya ternganggu, maka protein dapat terdenaturasi. Protein yang terdenaturasi dapat dicirikan dengan terbentuknya gumpalan/endapan. Jika konsentrasi protein dalam larutan kecil atau asam dan basa yang digunakan bersifat lemah/konsentrasi encer maka akan terbentuk koloid putih (Winarno, 1997).

Pada proses pemanasan protein akan mengalami denaturasi apabila dipanaskan pada suhu 55-750C. Laju denaturasi protein dapat mencapai 600 kali untuk tiap kenaikan 100C. Denaturasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isoelektriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isoelektriknya masih dapat larut pada pH di luar titik isoelektrik tersebut. Air ternyata diperlukan untuk proses denaturasi oleh panas (Amelia dkk, 2011). Sejalan dengan pendapat (Martoharsono,2006, yang menyatakan perlakuan panas dapat memberikan pengaruh yang menguntungkan dan merugikan terhadap protein. Pengaruh yang menguntungkan yaitu meningkatnya daya guna protein, sebab adanya pemanasan pada proses pengolahan dapat menginaktifkan atau menurunkan protein inhibitor. Pemanasan akan membuat protein terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. (Amelia dkk, 2011), menyatakan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar protein dapat dirusak akibat panas. Energi kinetik yang meningkat akibat suhu tinggi dapat menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar semakin cepat sehingga merusak ikatan molekul tersebut. Selain itu, energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida.

Penambahan asam asetat pada filtrat yang telah dipanaskan berarti menambahkan konsentrasi dari ion H+ yang kemudian akan mengadakan reaksi dengan muatan negatif protein yang berasal dari gugus hiroksil bebasnya. Semakin banyak konsentrasi H+ yang ditambahkan maka semakin banyak pula penurunan pH dari filtrat sehingga titik isoelektriknya semakin dekat. Apabila pH isoelektrik sudah tercapai maka muatan yang saling berlawanan akan saling menetralkan sehingga akan terbentuk gumpalan. Semaikn kecil pH buffer asetatnya, semakin banyak endapannya. Karena pH yang kecil akan banyak membentuk endapan berarti selisih muatan listriknya antara yang positif dan negatif sama. Sehingga, tidak dapat bergerak dan membentuk endapan atau warna keruh (Triyono, 2010).

Mekanisme penggumpalan protein sebenarnya masih belum sepenuhnya diketahui, namun paling tidak melalui 2 cara. Pertama, akibat denaturasi protein, konformasi molekul protein berubah, baik karena pemanasan atau kimiawi. Kedua, tahap penggumpalan karena peristiwa denaturasi protein merupakan syarat mutlak, dimana penggumpalan akan membuka kesempatan molekul protein saling berinteraksi satu dengan lainnya, sehingga peristiwa gelatinasisi atau terbentuknya gel terjadi (Amelia dkk, 2011)

Dalam ilmu kimia, pencampuran atau penambahan suatu senyawa dengan senyawa yang lain dikatakan bereaksi bila menunjukan adanya tanda terjadinya reaksi, yaitu adanya perubahan warna, timbul gas, bau, perubahan suhu dan adanya endapan. Pencampuran yang tidak disertai dengan tanda demikian, dikatakan tidak terjadi reaksi kimia (Elisa, 2014).

Endapan yang tidak terbentuk pada bahan susu kedelai dengan pereaksi  NaOHII dapat terjadi karena NaOH yang ditambahkan tidak cukup banyak atau dari konsentrasi pereaksinya, sehingga belum mampu untuk mendenaturasikan protein yang terdapat dalam larutan.

 

Tabel 2. Hasil denaturasi

Pereaksi P. Telur S. Kedelai S. Murni
HCl I +++ +++ +++
NaOH II ++ +
AsetatIII +++ ++ +++
HClI +asetat + ++ +++
NaOHII+asetat ++ +++ +
AsetatIII+asetat ++ ++ +++

Keterangan : tidak ada endapan (-), sangat sedikit (+), sedikit (++), banyak (+++)

Pertanyaan

  1. Sebutkan faktor yang mempengaruhi denaturasi!
  2. Sebutkan struktur kimia pada asama amino!
  3. Sebutkan sifat fungsional protein!

Jawaban

  1. Pemanasan pada suhu 55-75 oC, suhu rendah (di bawah titik beku air), pH yang ekstrim, pelarut organik (alkohol, aseton), penambahan garam, pengadukan intensif.
  2. Komponen organik yang memiliki 2 gugus fungsional utama, yaitu gugus amin (NH2) dan gugus karboksil (COOH). Gugus lainnya adalah gugus alkil/ rantai karbon (R) dan gugus hidrogen (H) yang terikat pada α-Carbon.
  3. Kelarutan protein, sifat hidrasi/daya ikat air, sifat kapasitas emulsifikasi, agresi dan pembentukan gel, sifat pembentuk buih serta sifat sebagai enzim

 

KESIMPULAN

Penambahan pelarut organik akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan. Dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan.

Endapan pada praktikum denaturasi terbentuk karena disebabkan denaturasi protein, yaitu pemanasan dan penambahan asam. Pemanasan dan penambahan asam ini akan menyebabkan rusaknya struktur protein sehingga protein akan mengendap. Denaturasi dapat mengubah sifat protein menjadi sukar larut dalam air. Hal ini bahwa pada uji denaturasi pada titik isoelektris protein bersifat hidrofobik.

Jenis asam mempunyai perbedaan sifat daya koagulasi yang berbeda. Jenis asam dan pengaruh pH larutan yang sangat berpengaruh pada kemampuan untuk mengkoagulasi protein, dan endapan protein yang terjadi. Protein yang menggumpal atau mengendap merupakan salah satu ciri fisik dari terdenaturasinya suatu protein. Denaturasi dapat mengubah sifat protein menjadi sukar larut dalam air.

Endapan yang tidak terbentuk pada bahan susu murni dengan pereaksi  HClI dan NaOHII pada uji pengendapan dengan alkohol dan susu kedelai dengan pereaksi  NaOHII pada uji denaturasi dapat terjadi karena HCl dan NaOH yang ditambahkan tidak cukup banyak atau dari konsentrasi pereaksinya, sehingga belum mampu untuk mendenaturasikan protein yang terdapat dalam larutan.

 

DAFTAR PUSTAKA

Amelia, Aprizal R., Bahalwan A. H., Cahyarani C. S., Malik M., Rakhmaniar, Syafiqa Eka. (2011). Uji Kualitatif Protein. Jakarta. UIN Syarif Hidayatullah

Bambang Agus, Murtidjo. (2003). Pemotongan Penanganan Dan Pengolahan Daging Ayam. Yogyakarta. Kanisius.

Brady, James E. 1999. Kimia Universitas Asas dan Struktur. Jakarta. Binarupa Aksara

Bintang, Maria. (2010). Biiokimia Teknik Penelitian. Jakarta. Erlangga.

Chang, Raymond. (2008). Kimia Dasar 2. Jakarta. Erlangga.

Dewi Yuliani Nia. (2013). Penetapan Kadar dan Analisis Profil Protein dan Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam (Nigella Sativa Linn.) Dengan Metode SDS-PAGE dan KCKT. Jakarta. UIN Syarif Hidayatullah.

Elisa. (2014). Reaksi Uji Terhadap Asam Amino. Banda Aceh. Universitas Syiah Kuala.

Muslim, Wahyuew. 2010. Resipitasi Plasma Protein Untuk Uji Farmakokinetik. Bandung. Institut Teknologi Bandung

Fesseden R. J. (1986). Kimia Organik. Penerjemah : A.H

Martoharsono. (2006). Biokimia 2. Yogyakarta. Universitas Gajah Mada

Rismaka. 2009. Uji Kualitatif dan Asam Amino. www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan-asam-amino.html. Diakses pada tanggal 07 Mei 2017. Garut.

Triyono Agus. 2010. Mempelajari Pengaruh Penambahan Beberapa Asam Pada Proses Isolasi Protein Terhadap Tepung Protein Isolat Kacang Hijau (Phaseolus radiatus L. Subang. Balai Besar Pengembangan Teknologi Tepat Guna.

Winarno, F.G. (1997). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta. Gramedia Pustaka.

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *